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  • 显微切割的影响因素

    作者:佚名    文章来源:医学教育网    点击数:    更新时间:2010/3/6

      由于显微切割常常是与多种方法结合使用,影响显微切割实验最终结果的因素也就多种多样。这就需要在实验过程中把握一个原则,即一切与显微切割结合的技术中影响因素应同时列为显微切割实验最终结果的影响因素,在实验的过程中予以考虑。与不同的方法结合决定了需要对显微切割的材料进行不同的处理,如显微切割后需要进行RNA的相关分析,则所有过程必需确保无RNA酶的降解干扰;如显微切割后需要进行基因组DNA的相关分析,则应该保持基因组的相对完整性,避免在样品处理过程中造成DNA的降解和断裂,这就需要选择合适的方法进行样品的固定和保存,例如在福尔马林固定石蜡包埋的组织中由于固定包埋剂的影响存在较多的DNA断裂,而且随着保存时间的延长,DNA的断裂越多,因此欲分析的DNA需要保持完整时,选择石蜡切片进行显微切割则不合适;如果要对石蜡组织切片显微切割后进行PCR分析,则设计引物时应注意使其决定扩增的片段长度不要太长,一般在保证特异性的前提下,最好选择扩增片段长度200bp以下的引物。

      运用显微切割技术时应该分离多少细胞或亚细胞才能满足实验研究的需要,这要受多种因素的影响。例如单细胞显微切割用于DNA分析所需的单个细胞数,依研究目的、标本固定方式、切片厚度、细胞大小、DNA提取方式、PCR扩增片段长度的不同而有差异。Dietmaier等比较了用流式细胞仪分选细胞和用显微切割从冰冻切片和石蜡切片上切割单个细胞用于突变分析所需的最少细胞数的差别,结果冰冻切片与流式细胞仪相同,至少需要10个细胞,而石蜡切片一般需要30个细胞。

      如果要分析切割细胞中病原微生物的DNA情况,则细胞内病原体的拷贝数越多,需要的细胞数越少。冰冻组织切片较石蜡组织切片更适宜于对细胞基因组DNA的分析。在不影响形态观察的前提下,作为显微切割的组织切片越厚越好,对于石蜡组织一般主张选用7μm的连续切片较为适宜。分析基因组DNA时,细胞越大,则需要切割更多的细胞,才能保证包含细胞的全部基因组。从显微切割的细胞中提取DNA多采取直接法,即采用蛋白酶K消化后再加热灭活酶的方法,这样可以减少在提取过程中DNA的丢失。在采用激光捕获显微切割时或可以切割较多的细胞时,也可采用酚氯仿抽提的常规方法提取细胞DNA。由于如前所述的石蜡组织中存在DNA的断裂,如果要对其切割的细胞进行PCR分析,则扩增的片段越长,需要切割的细胞数越多。

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