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贲门痉挛-放射诊断学 本病病因尚未完全明了,但因发现其食管下段肠肌丛(奥氏神经丛)的神经节细胞变性和数量减少,多认 |
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用羟基磷灰石纳米粒作内耳基因治疗新载体的体内外研究 |
作者:佚名 文章来源:医学教育网 点击数: 更新时间:2010/3/6 |
该项研究目的是研制羟基磷灰石(hydroxyapatite,HAT)纳米粒,评价其作为新的内耳基因转染载体的可能性。
方法采用用化学共沉淀-水热合成法制备HAT载体。经DNA电泳做不同pH值和HAT含量的DNA结合实验,了解HAT纳米粒对DNA的结合和保护作用;用四甲基偶氮唑盐法观察HAT纳米粒对宫颈癌上皮Hela细胞的毒性;用Hela细胞和小鼠耳蜗原代螺旋神经节细胞做神经营养素3(neurotrophin3,NB)体外转染实验(绿色荧光蛋白基因荧光显微镜法)及NB的蛋白印迹分析,观察HAT介导的NB基因对活细胞的体外转染能力和基因表达情况;经实验性兴奋性耳毒性损伤豚鼠的耳蜗外淋巴腔灌注HAT纳米载体-含增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)质粒载体-NT3基因复合物(HAT—pEGFPC2-NT3),用免疫组化(二氨基联苯胺法)观察NT3在耳蜗的表达,以了解HAT纳米载体在活体动物耳蜗介导基因转染的能力。结果含量250.0μg/ml,pH值3~7是这种长约40~50nm的短棒状HAT纳米粒能完全结合重组质粒pEGFPC2-NT3的最低含量混悬液和最佳pH环境,并可有效保护基因不被核酸酶(DNaseⅠ)破坏。四甲基偶氮唑盐法观察HAT纳米粒从62.5μg/ml至500.0μg/ml4种混悬液对Hela细胞存活率无明显影响,细胞形态无变化。EGFP荧光显微镜观察显示,HAT纳米载体对Hela细胞的基因转染率为15.7%±2.6%(-↑x±s);将HAT—pEGFPC2-NT3转染培养的小鼠耳蜗神经元,也可见明显的EGFP表达。NT3免疫组化显示,向实验性兴奋性耳蜗损害豚鼠的耳蜗外淋巴腔灌注HAT—pEGFPC2-NT3,可见活体耳蜗神经元内有明显的NT3蛋白表达。
得出结论HAT纳米粒不仅可介导NT3基因的体外转染,而且可介导其耳蜗活体转染;尽管转染率有待提高,但由于没有病毒载体转染造成的生物威胁,仍不失为一种很有研究价值的非病毒型内耳基因治疗载体。
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