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贲门痉挛-放射诊断学 本病病因尚未完全明了,但因发现其食管下段肠肌丛(奥氏神经丛)的神经节细胞变性和数量减少,多认 |
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shRNA介导的RNA干扰对小鼠T淋巴细胞CD28基因的沉默效应 |
作者:佚名 文章来源:医学教育网 点击数: 更新时间:2010/3/6 |
该项研究目的是探讨短发夹状RNA(shRNA)对C57BL/6J小鼠T淋巴细胞CD28共刺激分子基因沉默效应,评价shRNA对目的基因干扰效应的时效性和稳定性,筛选出高效的干扰序列用于后期的动物实验。
方法采用首先构建3个载有CD28特异性shRNA(shRNA1~3)的表达质粒和1个非特异性shRNA表达质粒,将其分别转染小鼠脾淋巴细胞,以非特异性的shRNA表达质粒组和未转染组分别作为阴性对照和空白对照,采用实时荧光定量PCR和Westernblot方法分别从基因和蛋白质水平评价转染1—20d内CD28shRNA对CD28基因的干扰效应,并筛选出干扰效率最高的序列。结果①成功构建了CD28shRNA表达载体;②3种CD28shRNA均可在mRNA和蛋白质水平有效沉默目的基因。与实验对照组比较差异有统计学意义(P〈0.01):CD28mRNA拷贝数持续降低,3种CD28shRNA转染C57BL/6J小鼠脾细胞20d,小鼠脾细胞CD28mRNA拷贝绝对数分别下降了99.62%、99.89%和99.80%;CD28蛋白表达水平分别降低了(84.90±0.65)%、(96.49±0.03)%和(91.76±0.32)%,以CD28shRNA2组的抑制效率最高(P〈0.01)。
由此得出结论①特异性的CD28shRNA可长期、稳定地介导CD28基因沉默;②针对CD28基因不同位点的不同shRNA也有干扰效率的差异。
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