用痰，淋巴结，骨髓，肝组织活检，血，尿或口腔溃疡分泌物培养出组织胞浆菌可以确诊。溶解离心或血沉棕黄层培养能提高血标本的阳性检出率。显微组织病理学检查结果也可有力地提示诊断。经特殊染色的组织标本（Gomori乌落托品银染色，PAS或Gridley银染色）可见巨噬细胞，血单核细胞或中性细胞内具有特征性成簇的，小而卵圆形的酵母菌。伴有艾滋病的广泛感染患者，外周血或血沉棕黄层经赖特或吉姆萨染色可见细胞内的酵母菌。用酶测定或放射性免疫测定，可从血清，尿，脑脊液或支气管肺泡洗出液标本中检出组织胞浆菌抗原。尽管有报道检测组织胞浆菌抗原是敏感和特异的，但已发现与其他真菌（如粗球孢子菌，皮炎芽生菌，巴西副球孢子菌，马内菲青霉菌）存在罕有的交叉反应。然而，该项检测目前只在印第安纳波利斯的组织胞浆菌病参照实验室进行，其结果尚未被其他实验室重复。组织病理学和免疫血清学诊断最终应以培养阳性来确证。